量化 NAD+ 及其在小鼠坐骨神經中的代謝物
簡介
煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）及其代謝物在老化與神經退化中的關鍵成分已被廣泛認可。為推動針對老化與神經退化疾病的生化研究與介入進展，準確量化NAD+及其代謝物水平在NAD+回收途徑中具有極大意義。在此，應用一種穩健且精確的 LC-MS/MS 方法，量化正常與受傷小鼠坐骨神經中的 NAD+ 及其代謝物水平。現有 NAD+ 及其代謝物量化方法的限制
傳統量化NAD+及其代謝物的方法，如HPLC-UV、NMR、毛細管區電泳或比色酶測定法，在靈敏度、選擇性及間接測量等方面面臨各種挑戰。至於現有的細胞或組織NAD+及其代謝物測量LC-MS/MS檢測，仍有許多困難待克服，例如延遲運行時間、層析保留行為不良及峰型不理想。此外，NAD+ 回收途徑中僅能涵蓋一至三種物質。LC-MS/MS 方法的改良
基於現有的 LC-MS/MS 檢測，進行色譜條件、替代基質及 MS/MS 條件的修正。具體來說，5 μM 的亞甲基磷酸作為移動相添加劑，明確促進訊號強度與峰值形狀。由於 Never 樣本相對乾淨且簡單且體積小，超純水被用作替代基質測試。取代親水互動液相層析柱與高碳酸鹽柱，採用Waters Atlantis Premier BEH C18 AX柱，其獨特的MaxPeak HPS高性能表面技術（鈍化柱內壁、去除金屬表面）實現所有分析物的高重複性、峰值對稱性及基線分離。此外，MS條件優化以最小化環狀腺苷二磷酸核糖（cADPR）通道中的NAD+干擾訊號，同時維持cADPR與煙醯胺單核苷酸（NMN）的反應，離子噴霧電壓為4000V，渦輪加熱器溫度為450°C，氣體1為50 psi，氣體2為50 psi，簾式氣體為30 psi，碰撞氣體為12 psi。
神經樣本代表性層析圖（正常與損傷）
這五種分析物皆達到基線分離，其中cADPR是神經退化模型中的敏感生物標記。在此，坐骨神經軸索切開術會誘導軸突退化，導致受損神經中NAD+水平降低及NMN水平升高，導致NMN/NAD+比例約增加兩倍。同時，煙醯胺（NAM）和二磷酸核糖腺苷（ADPR）的濃度約降低了2倍，而cADPR的濃度則增加了超過8倍。這些結果與先前報告的研究一致，驗證了此改良 LS-MS/MS 方法在定量 NAD+ 及其代謝物上的準確性。
結論
此改良版 LC-MS/MS 方法能在短短 5 分鐘內有效分離 NAD+、NMN、NAM、ADPR 及 cADPR，有助於早期診斷各種神經疾病及老化與神經退化性疾病的藥物開發。參考資料
Ma Y、Deng L、Du Z。開發與驗證一種LC-MS/MS方法，用於量化小鼠坐骨神經NAD+及相關代謝物，並應用於神經損傷動物模型。J Chromatogr A. doi：10.1016/j.chroma.2024.464821邦塔克南
邦塔克自2012年起，致力於輔酶及天然產品原料的研發、製造與銷售，擁有自有工廠、超過170項全球專利及強大的研發團隊。BONTAC在生物合成方面擁有豐富的研發經驗與先進技術，NAD 及其前身（例如：NMN 與 NR）。需選擇多種NAD類型，包括NAD內質層級（內毒素去除）、NAD級I（IVD/膳食補充品/化妝品生粉）、NAD級II（API/中間體）及NAD IV級（若溶解度要求更高），可以凍乾粉末或結晶粉末形式提供。BONTAC NAD 的純度可達 98% 以上。
