透過操控氧化還原輔因子再生來進行生長耦合酶工程

越來越多種類的化學品正透過生物技術手段，從可再生原料生產。生物製程高度依賴酵素催化來高效生產這些化合物。因此，確保酵素在所需環境中發揮最佳效能，對永續生產極具重要性。

底物特異性、催化速率及（熱）穩定性等特性，是必須優化以高效進行酵素驅動生物過程的關鍵因素。此優化可能耗時、昂貴且具挑戰性，因此具有理想特性的生長耦合選擇與工程酵素極具需求，且具有成本效益。

利用生長耦合選擇作為酵素選擇形式的優點，該選擇涉及將酵素的活性與細胞生長連結。此方法可作為高通量選擇策略，可透過確保生長依賴目標酶的產物合成，或將酵素活性與細胞的全能狀態連結來達成。合成生物學可用於工程化適合生長耦合選擇的菌株，近期進展聚焦於工程化缺乏氧化還原輔因子對氧化或還原態的菌株，這些菌株可作為酵素工程平台。這些平台的使用有望加速改良生物催化劑與生物製程的開發。

透過輔因子輔助營養的生長耦合帶來的益處

利用輔因子輔助營養作為選擇方法，工程化參與某些化學物質生物合成的酵素的好處，例如脂質、生物燃料、氣體、有機溶劑或高分子化合物。此方法具有多項獨特優勢，包括能獨立於目標底物或產物選擇所需產物，更容易偵測酵素活性提升，並提供酶活性提升的讀數。此外，輔因子輔助營養素作為生長耦合平台的使用也有益，因為氧化還原輔因子在微生物代謝中的普遍特性，使得工程策略可橫向轉移至其他感興趣的微生物，且酵素可直接在目標微生物宿主的環境中被工程化。（如圖1所示）

圖1：多種廣泛使用的酵素工程篩選/篩選技術的比較

NADH氧化缺乏的突變體

大腸桿菌中NADH的氧化可透過兩種途徑進行，視氧氣供應情況而定。在有氧條件下，NADH主要透過呼吸被氧化以產生ATP;而在無氧條件下，則可透過發酵途徑氧化產生乳酸和乙醇。大腸桿菌的突變菌株在厭氧生長期間無法利用混合發酵途徑進行NADH氧化，因此被用來驅動NADH氧化途徑，進行多種化學物質的厭氧合成，如2-甲基丙烷-1-醇、2,3-丁二醇、1-丁醇及L-丙氨酸。這些突變株也被用來利用類似的氧化還原原理來工程化酵素，進而產生改良的變異體。所得菌株可用於工程化其他依賴NAD（P）H的酶與途徑。

缺乏NAD+還原的突變體

Wenk 等人透過刪除二氫脂酰脫氫酶（LPD）基因，創造出大腸桿菌株，但由於缺乏丙酮酸脫氫酶活性，該菌株無法從乙酸酯代謝產生還原能力（NADH 和 NADPH）。這使得該品系在以醋酸酯作為唯一碳源進行有氧生長時，展現出減弱能量的輔助營養作用。（如圖2所示）當該菌株補充上層糖解底物，或在表達NAD+依賴的甲酸、乙醇或甲醇脫氫酶及其底物時，能在乙酸酯上生長。該菌株未用於酵素工程，僅評估氧化還原輔因子增生。
 

圖2：中樞代謝

NADPH氧化缺乏的突變體

誘導大腸桿菌NADP+增生有兩種不同的策略，分別是透過工程化糖酵解途徑來過度產生NADPH。第一種策略是刪除原生的 gapA 基因，並表達異源的 NADP+ 依賴性 GAPDH 酶;第二種策略則是將碳流重新導向至戊糖磷酸途徑。產生的菌株無法在葡萄糖下生長，但在不同條件下生長，第一種菌株在無氧條件下生長，第二菌株則在有氧條件下以甘油為底物生長。這些菌株用於工程化具有更優異性特性的酵素，包括底物特異性、催化活性及熱穩定性。

NADP+還原缺乏的突變體

三種不同的細菌——大腸桿菌、P. putida和C. glutamicum——已被基因改造為NADPH-輔助營養型，意即它們需要外源性NADPH才能生長。以大腸桿菌和芽珠菌為例，為了避免以葡萄糖作為碳源而導致NADP+還原，中樞代謝酵素被敲除;而在P. putida中，則利用CRISPR/nCas9輔助工程依序干擾目標基因組，以了解它們在氧化還原代謝中的參與。NADPH-輔助營養菌株隨後被用於基於輔因子特異性的生長偶聯酶工程。使用大腸桿菌進行的單輪誘變，產生了迄今最有效且特異性的NADP+依賴型脫氫酶，而P. putida與C. glutamicum則是首批可用於此類工程的物種菌株。

缺乏 NMN+ 還原的突變體

開發出一種生長耦合選擇系統，將輔因子循環與生長連結起來，基於NMN+還原不足。使用了大腸桿菌SHuffle菌株，該菌株在兩個參與還原穀胱甘肽產生的基因中帶有缺失。透過理性誘變開發出一種依賴 NMNH 的穀胱甘肽還原酶，將此過程與 NMN+/NMNH 循環連結，而依賴 NMN+ 的葡萄糖脫氫酶則用於支持 NMN+/NMNH 輔因子循環，從而促進生長。該研究首次將非典型氧化還原輔因子增生應用於生長耦合酶工程，產生出具有更佳催化效率與體外時間穩定性的熱穩定磷酸鹽脫氫酶變異體。這項工作為生長偶聯酶工程提供了有用的菌株，該菌株依賴於NMN+/NMNH循環，並對非典型氧化還原輔因子的還原狀態具有輔助營養作用。

透過氧化還原輔因子進行生長耦合的潛力，成為生物催化劑工程化的強大工具，特別是在永續生物生產的情境下。儘管在氧化還原輔因子自養菌株的產生上已有相當進展，該聲明仍顯示仍有數條研究方向尚未探索。其中一項是工程化非大腸桿菌的輔助營養菌株，這可能為生長偶聯酶工程開啟新可能。

整體而言，這顯示基於氧化還原輔因子的生長偶聯技術，對於工程生物催化技術來說，特別是對於生產無法滿足其他高通量酵素工程方法要求的產品來說，是一項重大機會。報告強調開發更多功能且高效的生物催化劑以促進永續生物生產，並強調持續研究的重要性。


參考文獻：Jochem R. Nielsen a、Ruud A. Weusthuis b、Wei E. Huang a，《透過操控氧化還原輔因子再生的生長偶聯酶工程》，生物技術進展，2023年。