通過操縱氧化還原輔因數再生的生長偶聯酶工程

現在，通過生物技術手段從可再生原料中生產出越來越多的化學品。生物過程嚴重依賴酶催化來有效生產這些化合物。因此，確保酶在其所需環境中發揮最佳性能對於可持續生產具有高度意義。

底物特異性、催化速率和（熱）穩定性等特性是必須優化的幾個關鍵因素，以實現高效的酶驅動生物工藝。這種優化可能耗時、昂貴且具有挑戰性，因此對於生長偶聯選擇來說，可能是一種有效且具有成本效益的方法，具有理想特性的工程酶備受追捧。

使用生長偶聯選擇作為酶選擇的一種形式的優點，它涉及將酶的活性與細胞的生長聯繫起來。該方法可以用作高通量選擇策略，可以通過確保生長依賴於靶酶的產物合成或將酶的活性與細胞的全域能量狀態聯繫起來來實現。合成生物學可用於設計適合生長偶聯選擇的菌株，最近的進展集中在工程菌株上，這些菌株缺乏氧化還原輔因數對的氧化或還原狀態，可以作為酶工程平臺。這些平臺的使用可以加速改進的生物催化劑和生物工藝的開發。

通過輔因數營養不良進行生長偶聯的好處

使用輔因數營養不良作為工程酶的選擇方法，用於某些化學品（如脂質、生物燃料、氣體、有機溶劑或聚合物化合物）的生物合成。這種方法具有幾個獨特的優點，包括能夠獨立於目標底物或產品選擇所需產品，使其更容易檢測改進的酶活性，並提供用於檢測改進的酶活性的讀數。此外，使用輔因數營養輔助因數作為生長偶聯平臺是有益的，因為氧化還原輔因數在微生物代謝中無處不在的性質意味著工程策略可以橫向轉移到其他感興趣的微生物，並且酶可以直接在所需微生物宿主的環境中進行工程設計。（如圖 1 所示）

圖1：幾種廣泛使用的酶工程篩選/篩選技術的比較

缺乏NADH氧化的突變體

大腸桿菌中NADH的氧化可以通過兩種途徑發生，具體取決於氧氣的可用性。在有氧條件下，NADH主要通過呼吸作用被氧化產生ATP，而在厭氧條件下，它可以通過發酵途徑被氧化產生乳酸和乙醇。大腸桿菌的突變菌株在厭氧生長過程中無法使用混合發酵途徑進行NADH氧化，已被用於驅動NADH氧化途徑，用於厭氧合成各種化學物質，如2-甲基-1-丙醇、2,3-丁二醇、1-丁醇和L-丙氨酸。這些突變菌株也被用於通過利用類似的氧化還原原理來設計酶，從而產生改進的變體。所得菌株可用於設計其他NAD（P）H依賴性酶和通路。

缺乏NAD+還原的突變體

Wenk 等人通過刪除二氫脂醯脫氫酶 （lpd） 基因創造了一種大腸桿菌菌株，由於缺乏丙酮酸脫氫酶活性，導致該菌株無法從乙酸鹽代謝中產生還原力（NADH 和 NADPH）。這導致該菌株在醋酸鹽作為唯一碳源上有氧生長時表現出營養不良以降低功率。（如圖 2 所示）當補充上部糖酵解底物或用各自的底物表達NAD+依賴性甲酸酯、乙醇或甲醇脫氫酶時，該菌株能夠在乙酸鹽上生長。該菌株未用於酶工程，僅評估氧化還原輔因數營養不良。
 

圖2：中樞代謝

缺乏NADPH氧化的突變體

在大腸桿菌中誘導 NADP+ 生長不良有兩種不同的策略，依賴於工程化糖酵解途徑以過量產生 NADPH。第一種策略涉及刪除天然 gapA 基因並表達異源 NADP+ 依賴性 GAPDH 酶，而第二種策略涉及通過磷酸戊糖途徑重定向碳通量。所得菌株不能在葡萄糖上生長，但在不同條件下表現出生長，第一個菌株在厭氧條件下生長，第二個菌株在有氧條件下以甘油為底物生長。這些菌株用於工程酶，具有改進的特性，包括底物特異性、催化活性和熱穩定性。

缺乏NADP+還原的突變體

三種不同的細菌，大腸桿菌，惡臭瘧原蟲和谷氨酸衣原體，已被設計為NADPH營養不良，這意味著它們需要外源性NADPH才能生長。在大腸桿菌和谷氨酸衣原體的情況下，當葡萄糖作為碳源提供時，中樞代謝酶被敲除以避免 NADP+ 降低，而在惡臭瘧原蟲中，CRISPR/nCas9 輔助工程用於依次破壞靶基因集，以了解它們參與氧化還原代謝。然後將NADPH營養不良菌株用於基於輔因數特異性的生長偶聯酶工程。使用大腸桿菌進行單輪誘變產生了迄今為止最有效和特異性的NADP+依賴性甲酸脫氫酶，而惡臭假單胞菌和谷氨酸衣原體代表了其物種中可用於此類工程的第一批菌株。

缺乏NMN+還原的突變體

開發了一種生長偶聯選擇系統，以基於NMN+減少缺陷的輔助因數迴圈和生長聯繫起來。使用大腸桿菌SHuffle菌株，該菌株攜帶參與還原谷胱甘肽產生的兩個基因的缺失。通過合理誘變開發了NMNH依賴性谷胱甘肽還原酶，將該過程與NMN+/NMNH迴圈聯繫起來，並使用NMN+依賴性葡萄糖脫氫酶支援NMN+/NMNH輔因數循環，從而支持生長。該研究還首次將非經典氧化還原輔因數營養不良應用於生長偶聯酶工程，從而產生了一種熱穩定的亞磷酸鹽脫氫酶變體，在體外具有更高的催化效率和時間穩定性。這項工作為生長偶聯酶工程提供了一種有用的菌株，該菌株依賴於NMN+/NMNH迴圈和營養不良，以實現非經典氧化還原輔因數的還原狀態。

通過氧化還原輔因數進行生長偶聯的潛力是設計生物催化劑的有力工具，特別是在可持續生物生產的背景下。儘管在氧化還原輔因數營養不良菌株的產生方面取得了相當大的進展，但該聲明表明仍有幾種未探索的研究途徑。其中之一涉及工程大腸桿菌以外的生物體的輔因數營養菌株，這可能為生長偶聯酶工程開闢新的可能性。

總體而言，它表明使用基於氧化還原輔因數的生長偶聯代表了工程生物催化的主要機會，特別是對於生產無法滿足其他高通量酶工程方法要求的產品。它強調需要為可持續生物生產開發更通用和更有效的生物催化劑，並強調在這一領域繼續研究的重要性。


參考資料：Jochem R. Nielsen a， Ruud A. Weusthuis b， Wei E. Huang a， Growth-coupled enzyme engineering through manipulation of redox cofactor regeneration， Biotechnology Advances， 2023.