通過調控氧化還原輔因子再生的生長耦合酶工程

现在，越来越多的化学品通过生物技术手段从可再生原料中生产。生物过程在很大程度上依赖酶催化来高效生产这些化合物。因此，确保酶在其所需环境中发挥最佳性能对于可持续生产具有重要意义。

底物特异性、催化速率和（热）稳定性等特性是高效酶驱动生物过程中必须优化的几个关键因素。这种优化可能耗时、昂贵且具有挑战性，因此，寻找有效且经济的方式，可能用于生长偶联选择，工程化具有理想特性的酶，备受追捧。

利用生长偶联选择作为酶选择形式具有优势，该方法将酶的活性与细胞的生长联系起来。这种方法可用作高通量选择策略，可通过确保生长依赖于目标酶的产物合成，或将酶的活性与细胞的整体能量状态联系起来来实现。合成生物学可用于工程化适合生长偶联选择的菌株，最近的进展集中在工程化缺乏氧化或还原态氧化还原辅因子对的菌株，这些菌株可作为酶工程平台。使用这些平台可能加速改进生物催化剂和生物过程的发展。

通过辅因子营养缺陷型进行生长偶联的益处

使用辅因子营养缺陷型作为选择方法，用于工程化参与某些化学品（如脂质、生物燃料、气体、有机溶剂或聚合物化合物）生物合成的酶，具有诸多独特优势，包括能够独立于目标底物或产物进行所需产物的选择，更容易检测到改进的酶活性，并提供检测改进酶活性的读数。此外，使用辅因子营养缺陷型作为生长偶联平台是有益的，因为氧化还原辅因子在微生物代谢中普遍存在，意味着工程策略可以横向转移到其他感兴趣的微生物中，并且酶可以在所需微生物宿主的环境中直接进行工程化。（如图1所示）

图1：几种广泛使用的酶工程筛选/选择技术的比较

NADH氧化缺陷型突变体

在大肠杆菌中，NADH的氧化可通过两条途径进行，具体取决于氧气的可用性。在有氧条件下，NADH主要通过呼吸作用氧化以生成ATP，而在无氧条件下，可通过发酵途径氧化生成乳酸和乙醇。无法在厌氧生长期间使用混合发酵途径进行NADH氧化的大肠杆菌突变菌株已被用于驱动NADH氧化途径，以厌氧合成各种化学品，如2-甲基丙-1-醇、2,3-丁二醇、1-丁醇和L-丙氨酸。这些突变菌株也已通过利用类似的氧化还原原理用于酶工程，从而产生改进的变体。所得菌株可用于工程化其他NAD(P)H依赖性酶和途径。

NAD+还原缺陷型突变体

Wenk等人通过删除二氢硫辛酰胺脱氢酶（lpd）基因创建了一种大肠杆菌菌株，由于缺乏丙酮酸脱氢酶活性，该菌株无法从乙酸代谢中生成还原力（NADH和NADPH）。这导致该菌株在以乙酸为唯一碳源进行有氧生长时表现出对还原力的营养缺陷型。（如图2所示）当补充上部糖酵解底物或表达NAD+依赖型甲酸、乙醇或甲醇脱氢酶及其各自底物时，该菌株能够在乙酸上生长。该菌株未用于酶工程，仅评估了氧化还原辅因子营养缺陷型。
 

图2：中心代谢

NADPH氧化缺陷型突变体

有两种不同的策略可在大肠杆菌中诱导NADP+营养缺陷型，依赖于工程化糖酵解途径以过量产生NADPH。第一种策略涉及删除天然gapA基因并表达异源NADP+依赖性GAPDH酶，而第二种策略涉及将碳通量重定向通过磷酸戊糖途径。所得菌株无法在葡萄糖上生长，但在不同条件下表现出生长，第一种菌株在厌氧条件下生长，第二种菌株在以甘油为底物的有氧条件下生长。这些菌株用于工程化具有改进特性（包括底物特异性、催化活性和热稳定性）的酶。

NADP+还原缺陷型突变体

三种不同的细菌，大肠杆菌、恶臭假单胞菌和谷氨酸棒杆菌，已被工程化为NADPH营养缺陷型，意味着它们需要外源NADPH才能生长。在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的情况下，敲除了中心代谢酶以避免在提供葡萄糖作为碳源时进行NADP+还原，而在恶臭假单胞菌中，使用CRISPR/nCas9辅助工程依次破坏目标基因组以了解它们在氧化还原代谢中的参与。然后，基于辅因子特异性，将NADPH营养缺陷型菌株用于生长偶联酶工程。使用大肠杆菌进行单轮诱变产生了迄今为止最有效和最具特异性的NADP+依赖性甲酸脱氢酶，而恶臭假单胞菌和谷氨酸棒杆菌代表了其物种中首批可用于此类工程的菌株。

NMN+还原缺陷型突变体

開發了一種基於 NMN+ 還原缺陷的生長偶聯篩選系統，用以連結輔因子循環與生長。研究使用大腸桿菌 SHuffle 菌株，該菌株帶有兩個參與還原型穀胱甘肽生成之基因的缺失。透過理性突變開發出一種依賴 NMNH 的穀胱甘肽還原酶，以將此過程與 NMN+/NMNH 循環連結；並使用依賴 NMN+ 的葡萄糖脫氫酶來支持 NMN+/NMNH 輔因子循環，進而支持生長。本研究亦首次將非典型氧化還原輔因子營養缺陷型應用於生長偶聯酵素工程，產生了具有改善催化效率及體外時間穩定性的熱穩定亞磷酸脫氫酶變體。此工作提供了一個依賴 NMN+/NMNH 循環且對非典型氧化還原輔因子之還原態具營養缺陷型的有用菌株，適用於生長偶聯酵素工程。

透過氧化還原輔因子進行生長偶聯的潛力，是工程化生物催化劑的有力工具，特別是在永續生物生產的背景下。儘管在產生氧化還原輔因子營養缺陷型菌株方面已取得相當進展，此陳述表明仍有數個未探索的研究途徑。其中之一涉及工程化大腸桿菌以外生物的輔因子營養缺陷型菌株，這可能為生長偶聯酵素工程開啟新的可能性。

整體而言，此陳述表明基於氧化還原輔因子的生長偶聯代表了工程化生物催化作用的重要機會，特別是對於生產無法滿足其他高通量酵素工程方法要求之產物。它強調了開發更通用且高效之生物催化劑以實現永續生物生產的需求，並凸顯了持續研究此領域的重要性。


參考文獻：Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a，透過操縱氧化還原輔因子再生進行生長偶聯酵素工程，Biotechnology Advances，2023 年。