利用 Thio-NAD 循環之超靈敏 ELISA 檢測登革 NS1

超灵敏ELISA结合硫代-NAD循环在检测登革热NS1蛋白中的卓越优势

2024年1月15日

1. 簡介

登革熱是由登革病毒所引起的急性傳染病，登革病毒透過受感染的斑蚊屬（埃及斑蚊或白線斑蚊）叮咬傳播，主要症狀包括高燒、頭暈、頭痛、皮疹及嚴重疼痛（眼窩、肌肉、關節或骨骼疼痛）等。此疾病廣泛流行於熱帶和亞熱帶氣候地區。估計每年有 1 億至 4 億人感染，其中超過 80% 通常症狀輕微或無症狀。然而，若未妥善治療，嚴重登革熱可能增加死亡風險。因此，早期診斷此疾病對及時治療至關重要。

值得注意的是，非結構蛋白 1（NS1），一種高度保守的醣蛋白，主要在登革病毒感染期間分泌，被廣泛認為是登革熱的主要致病因子。因此，NS1 通常用作此疾病早期檢測的生物標記。

在本研究中，使用三明治酵素連結免疫吸附分析法 (ELISA) 結合硫代菸醯胺腺嘌呤二核苷酸（thio-NAD/S-NAD）循環法（以下稱為超靈敏 ELISA）來檢測 NS1，隨後與 NAAT 比較以確認其檢測準確度。

2. 傳統檢測方法的優缺點登革熱

目前，主要有四種檢測方法至關重要。登革熱。

病毒分離與鑑定具有高特異性，但耗時，至少需要 5 天。快速抗原檢測是其他方法中最快且最具成本效益的，但敏感性和特異性相對較低。基於 IgM 和 IgG 的血清學檢測受限於感染天數，因為the檢測必須延遲至抗體濃度上升至可檢測水平。

在臨床上，NAAT 常因其高敏感性和特異性而被應用於診斷。然而，此方法昂貴、費力且容易產生偽陽性，必須由受過訓練的人員操作。登革熱由於其高敏感度和特異性。然而，此方法昂貴、費力，且容易出現假陽性，必須由受過訓練的人員執行。為克服這些方法的缺點，本研究應用了一種新的檢測方法超靈敏 ELISA 。

3. 具 Thio-NAD 循環之超靈敏 ELISA 的工作流程

一對抗體文用於在三明治 ELISA 中捕捉 NS1 蛋白，而鹼性磷酸酶文標記於二級抗體上。除抗體外，雄酮衍生物、3α-羥類固醇脫氫酶、thio-NAD 和 NADH是用於建構 thio-NAD 酵素循環系統。在 thio-NAD 循環反應中，thio-NADH 以三角數方式持續累積，可直接在 405 nm 吸光度下測量。.

4. 超靈敏 ELISA 與 NAAT 在登革 NS1 蛋白檢測上的比較

在 NAAT 中，60 個檢體為登革陽性，25 個為登革陰性。這些登革陽性檢體的 NAAT 循環閾值（CT）範圍為 12.42 至 31.41。在超靈敏 ELISA 中，59 個檢體與 NAAT 結果相對應為陽性，而 25 個檢體與 NAAT 結果完全相對應為陰性。

與 NAAT 相比，超靈敏 ELISA 的敏感性和特異性分別為 98.3% 和 100%（表 2）。在 60 個 NAAT 確認為登革陽性的患者檢體中，僅有 1 個檢體在超靈敏 ELISA 中為陰性。NAAT 數據顯示該檢體為第 4 型 DENV 感染案例，CT 值為 21.59。超靈敏 ELISA 的結果與 NAAT 結果幾乎完全一致，kappa 值為 0.972（95% CI：0.917-1.0).