實現高產量甜葉菊的反應 Rebaudiosi|納德夫

優化反應條件以實現甜葉菊萊鮑迪甙D的高收率

15 9月 2023

高糖飲食導致肥胖、糖尿病、心血管疾病和高血壓等各種慢性疾病的患病率上升，構成了重大的全球公共衛生問題。甜葉菊萊鮑迪甙 D （Reb D）是一種從植物中提取的天然甜味劑，由於其零卡路里含量、強烈的甜味和令人愉悅的口感，作為糖替代品受到了極大的關注。然而，它在甜葉菊中的存在有限，以及與植物來源的糖基轉移酶的低溶解度和酶活性相關的挑戰阻礙了其廣泛的商業應用。為了應對這些問題，發現了一種名為YojK的新型糖基轉移酶，它起源於枯草芽孢桿菌168。本研究介紹了一種轉基因細菌糖基轉移酶YojK-I241T/G327N，其特點是溶解度高，催化效率高，為Reb D的工業化生產提供了巨大的潛力。

開發一種使用 YojK-I241T/G327N 和 AtSuSy 酶的級聯反應生產萊鮑迪甙 D 的高效方法。

為了解決植物來源的糖基轉移酶中溶解度低的問題，研究人員研究了使用枯草芽孢桿菌168的O-糖基轉移酶YojK的潛力。之所以選擇YojK，是因為其與各種底物（包括大分子）的糖基化活性得到了證明。在成功重組表達和純化后，YojK 用於糖基化 Reb A，從而產生甜葉菊 Reb D.酶動力學分析表明，與其他糖基轉移酶相比，YojK 對 Reb D 的催化活性較低。因此，該研究表明，結構引導工程有必要提高YojK的催化活性，以實現潛在的實際應用。（如圖1所示）

stevia ra to stevia rd mechanism
圖1

優化反應條件，實現高收率的萊鮑迪甙D。

可以優化反應條件，包括 pH 值、溫度和底物濃度，以實現 Srevia Reb D 的高收率。該研究使用分子動力學類比來研究 YojK-I241T/G327N 變體如何增強 Reb D 糖基化。與野生型不同，該變體在模擬期間在 Reb A 和 H14 之間保持穩定的氫鍵（如圖 2 所示）。這種穩定性也延伸到Reb A的O2原子和UDPG的C1P之間的距離。YojK-I241T/G327N變體的催化效率提高歸因於這些穩定的相互作用，表明其實用潛力。

large yield production of stevia rd
圖2

研究人員利用了涉及YojK-I241T/G327N和AtSuSy酶的級聯反應。關鍵的優化步驟包括在磷酸鉀緩衝液中將pH值維持在8.0，反應溫度為35°C，助溶劑DMSO為10%，蔗糖濃度為400 mM。（如圖3所示）

different conditions likely ph transformation
圖3

結論

值得注意的是，添加 1 mM UDPG 可合成 20.59 g/L Reb D，產率為 91.29%，超過了以前的研究。該過程證明瞭工業規模Reb D生產的潛力，特別是在YojK.YojK的結構工程中可以有效地表達在大腸桿菌BL21（DE3）中具有高溶解度。通過結構引導工程，創造了雙突變體YojK-I241T/G327N，通過回收蔗糖合酶AtSuSy催化的UDPG，實現了Reb D的大規模生產，收率高達91.29%。本研究表明，YojK-I241T/G327N是一種很有前途的工業規模Reb D生產工具。

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