优化反应条件以实现甜菊糖苷D的高产率
高糖飲食導致肥胖、糖尿病、心血管疾病和高血壓等各種慢性疾病的患病率不斷上升，構成重大的全球公共衛生問題。甜菊醇瑞鮑迪苷 D（Reb D）是一種源自植物的天然甜味劑，因其零熱量、強烈甜味和宜人的口感，作為糖替代品而受到廣泛關注。
然而，其在甜葉菊中的含量有限，且植物來源的糖基轉移酶存在溶解度和酶活性低的問題，阻礙了其廣泛的商業應用。針對這些問題，發現了一種源自枯草芽孢桿菌 168 的新型糖基轉移酶 YojK。本研究介紹了一種基因改造的細菌糖基轉移酶 YojK-I241T/G327N，其特點是溶解度高且催化效率高，為 Reb D 的工業化生產提供了巨大潛力。
開發一種利用 YojK-I241T/G327N 和 AtSuSy 酶級聯反應高效生產瑞鮑迪苷 D 的方法。
為了解決植物來源糖基轉移酶溶解度低的問題，研究人員探討了使用來自枯草芽孢桿菌 168 的 O-糖基轉移酶 YojK 的可能性。選擇 YojK 是因為其已證明對多種底物（包括大分子）具有糖基化活性。在成功進行重組表達和純化後，YojK 被用於糖基化 Reb A，從而生產出甜菊醇 Reb D。酶動力學分析顯示，與其他糖基轉移酶相比，YojK 對 Reb D 的催化活性較低。因此，研究建議需要進行結構引導的工程改造，以增強 YojK 的催化活性，使其具有實際應用的潛力。（如圖 1 所示）
圖1
優化反應條件以實現瑞鮑迪苷 D 的高產率。
反應條件，包括 pH、溫度和底物濃度，可以進行優化以實現甜菊醇 Reb D 的高產率。該研究使用分子動力學模擬來研究 YojK-I241T/G327N 變體如何增強 Reb D 的糖基化。在模擬過程中，該變體在 Reb A 和 H14 之間保持了穩定的氫鍵，而野生型則不然（如圖 2 所示）。這種穩定性也延伸至 Reb A 的 O2 原子與 UDPG 的 C1P 之間的距離。YojK-I241T/G327N 變體催化效率的提高歸因於這些穩定的相互作用，表明其實際應用潛力。
圖 2
圖3
結論
這種方法獲得了 83.47% 的 Reb D 產率。值得注意的是，添加 1 mM UDPG 可以合成 20.59 g/L 的 Reb D，產率高達 91.29%，超過了先前的研究。該過程展示了工業化規模生產 Reb D 的潛力，尤其是在對 YojK 進行結構工程改造之後。YojK 可以在大腸桿菌 BL21 (DE3) 中高效表達，且溶解度高。通過結構引導的工程改造，創建了雙突變體 YojK-I241T/G327N，通過蔗糖合酶 AtSuSy 催化 UDPG 的循環利用，實現了 Reb D 的大規模生產，產率高達 91.29%。本研究提出 YojK-I241T/G327N 是經濟有效地工業化生產 Reb D 的有前景的工具。
