從Reb A獲得高產量甜葉菊萊鮑迪甙D（Reb D）的反應

高糖飲食導致各種慢性疾病的患病率上升，包括肥胖、糖尿病、心血管疾病和高血壓，構成重大的全球公共衛生問題。甜葉菊萊鮑迪甙 D （Reb D） 是一種源自植物的天然甜味劑，由於其零卡路里含量、強烈的甜味和令人愉悅的口味特徵，作為糖替代品而受到廣泛關注。
然而，它在甜葉菊中的有限存在以及與植物來源糖基轉移酶的低溶解度和酶活性相關的挑戰阻礙了其廣泛的商業應用。針對這些問題，發現了一種源自枯草芽孢桿菌168的名為YojK的新型糖基轉移酶。本研究引入了轉基因細菌糖基轉移酶YojK-I241T/G327N，具有高溶解度和催化效率的特點，為Reb D的工業化規模生產提供了巨大的潛力。

開發一種使用YojK-I241T / G327N和AtSuSy酶的級聯反應生產萊鮑迪苷D的高效方法。

為了解決植物來源糖基轉移酶中溶解度低的問題，研究人員研究了使用YojK的潛力，YojK是一種來自枯草芽孢桿菌168的O-糖基轉移酶。選擇YojK是因為其對各種底物（包括大分子）的糖基化活性。在重組表達和純化成功后，YojK用於糖化Reb A，從而產生甜葉菊Reb D.酶動力學分析顯示，與其他糖基轉移酶相比，YojK對Reb D的催化活性較低。因此，該研究表明有必要進行結構引導工程，以增強YojK的催化活性，以實現潛在的實際應用。（如圖1所示）

圖1

優化反應條件，實現萊鮑迪甙D的高收率。

可以優化反應條件，包括pH、溫度和底物濃度，以實現Srevia Reb D的高產率。該研究使用分子動力學模擬來研究YojK-I241T / G327N變體如何增強Reb D糖基化。與野生型不同，該變體在模擬過程中在Reb A和H14之間保持穩定的氫鍵（如圖2所示）。這種穩定性也延伸到Reb A的O2原子和UDPG的C1P之間的距離。YojK-I241T/G327N變體的催化效率提高歸因於這些穩定的相互作用，這表明其實用潛力。

圖2

研究人員利用了涉及YojK-I241T / G327N和AtSuSy酶的級聯反應。關鍵的優化步驟包括在磷酸鉀緩衝液中將pH值保持在8.0，反應溫度為35°C，使用10%助溶劑DMSO，蔗糖濃度為400 mM。（如圖3所示）

圖3

結論

值得注意的是，添加1 mM UDPG可以合成20.59 g / L Reb D，產率高達91.29%，超過了以前的研究。這個過程證明瞭工業規模Reb D生產的潛力，特別是在YojK的結構工程之後。
YojK可以在大腸桿菌BL21（DE3）中高效表達，溶解度高。通過結構引導工程，創建了雙突變體YojK-I241T/G327N，通過回收蔗糖合酶AtSuSy催化的UDPG，實現了Reb D的大規模生產，產量高達91.29%。本研究將YojK-I241T/G327N作為經濟有效的工業規模Reb D生產的有前途的工具。